تصفح الكمية:0 الكاتب:محرر الموقع نشر الوقت: 2025-03-24 المنشأ:محرر الموقع
تفاعل سلسلة بوليميريز النسخ العكسي (RT-PCR) هو تقنية أساسية وقوية تستخدم في البيولوجيا الجزيئية لتضخيم وتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي. على عكس PCR التقليدي ، الذي يستخدم في المقام الأول لتضخيم الحمض النووي ، يتيح RT-PCR تضخيم الحمض النووي الريبي عن طريق تحويله أولاً إلى الحمض النووي التكميلي ([كدنا]. هذه الطريقة محورية للتطبيقات المختلفة مثل تحليل التعبير الجيني ، والكشف عن العوامل الممرضة ، والبحث الوراثي. يعد فهم المبادئ الكامنة وراء آلات RT-PCR أمرًا ضروريًا للباحثين الذين يرغبون في إجراء القياس الكمي الدقيق والدقيق للحمض النووي الريبي.
في هذه المقالة ، سوف نستكشف مبدأ RT-PCR ، مع التركيز على كيفية عمل آلة RT-PCR ، والعمليات الكيميائية الحيوية المعنية ، وتطبيقاتها في البحث والتشخيص العلمي.
RT-PCR هو مزيج من عمليتين رئيسيتين: النسخ العكسي وتفاعل سلسلة البلمرة. هنا ، نقوم بتفكيك كل خطوة ونشرح كيف يعمل داخل الجهاز.
تتضمن الخطوة الأولى في RT-PCR تحويل الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي التكميلي ([كدنا] من خلال عملية تسمى النسخ العكسي. هذه خطوة حاسمة ، لأن تفاعل سلسلة البلمرة نفسه يمكن أن يضاعف الحمض النووي فقط ، وليس الحمض النووي الريبي.
● إنزيم النسخ العكسي: يسمى الإنزيم المسؤول عن هذه العملية النسخ العكسي. إنه بوليميريز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي يربط الحمض النووي باستخدام الحمض النووي الريبي كقالب. هذا الإنزيم مشتق من الفيروسات القهقرية ، حيث يحدث النسخ العكسي بشكل طبيعي لتحويل جينومات الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي.
● الاشعال للنسخ العكسي: لبدء تخليق [كدنا] ، يلزم الاشعال. في RT-PCR ، يمكن استخدام ثلاثة أنواع من الاشعال:
○ الاشعال oligo (DT) ترتبط بذيل بولي-A من Messenger RNA (mRNA) ويستخدم عادة لتوليد [كدنا] كامل الطول من مرنا.
○ الاشعال العشوائي يرتبط في نقاط مختلفة على طول قالب الحمض النووي الريبي ويمكن استخدامه لمجموعة أوسع من أنواع الحمض النووي الريبي.
○ يتم استخدام الاشعال الخاص بالتسلسل لاستهداف تسلسل الحمض النووي الريبي المحدد ، مما يوفر خصوصية أعلى في عملية التحويل.
● التحكم في درجة الحرارة: يحدث النسخ العكسي عادة في درجات حرارة بين 40 درجة مئوية و 50 درجة مئوية. هذا يسمح لإنزيم النسخ العكسي بالعمل بكفاءة في توليف [كدنا] من قوالب الحمض النووي الريبي.
بمجرد أن يتم نسخ الحمض النووي الريبي إلى [كدنا] ، فإن الخطوة التالية هي التضخيم عبر PCR التقليدي. يعمل [كدنا] الآن كقالب لعملية التضخيم.
● ركوب الدراجات الحرارية: تقوم الماكينة بتنفيذ ركوب الدراجات الحرارية ، والتي تتضمن دورات بالتناوب من تمسخ ، الصلب ، وتمديدها لتضخيم [كدنا]. تتضمن خطوة تغيير التزايد تسخين التفاعل لفصل [كدنا] المزدوج تقطعت بهم السبل في خيوط واحدة. بعد ذلك ، يلد الاشعال إلى تسلسلها التكميلي على [كدنا] تقطعت بهم السبل خلال مرحلة الصلب. أخيرًا ، يطيل بوليميريز الحمض النووي الاشعال ، وتوليف خيوط جديدة من [كدنا].
● بوليميريز الحمض النووي: الإنزيم المسؤول عن تضخيم [كدنا] هو عادة بوليميريز TAQ ، وهو أمر قابل للحرارة ويمكنه تحمل درجات الحرارة العالية المطلوبة خلال مرحلة التحويل.
● اكتشاف مضان: في الوقت الفعلي PCR (أو PCR الكمي ، QPCR) ، ينبعث مضان أثناء عملية التضخيم لتوفير بيانات في الوقت الفعلي على كمية [كدنا] التي يتم إنتاجها. يتم استخدام أصباغ الفلورسنت مثل SYBR Green أو تحقيقات خاصة بالتسلسل للكشف عن الحمض النووي المتضخم ، مع وجود شدة مضان تتناسب بشكل مباشر مع كمية الحمض النووي في العينة.
تعد القدرة على قياس الحمض النووي الريبي باستخدام RT-PCR واحدة من أكثر ميزاتها قيمة. يتم تحقيق ذلك من خلال قياس مضان في كل دورة من عملية PCR. من خلال تتبع التألق المنبعث خلال المرحلة الأسية من التضخيم ، يمكن للباحثين تقدير الكمية الأولية من الحمض النووي الريبي في العينة.
● قيمة عتبة الدورة (CT): قياس المفتاح في PCR في الوقت الفعلي هو قيمة عتبة الدورة (CT) ، والتي تتوافق مع عدد الدورات المطلوبة للفلورات لتجاوز عتبة محددة مسبقًا. كلما انخفضت قيمة التصوير المقطعي ، كلما زادت الكمية الأولية من الحمض النووي الريبي في العينة ، حيث تستغرق دورات أقل للوصول إلى مستويات قابلة للاكتشاف من مضان.
يمكن تنفيذ RT-PCR باستخدام إما خطوة واحدة أو نهج من خطوتين ، اعتمادًا على الاحتياجات التجريبية.
في خطوة واحدة RT-PCR ، يتم تنفيذ كل من النسخ العكسي وتضخيم PCR في نفس أنبوب التفاعل. غالبًا ما يفضل هذا النهج عندما يحتاج سير العمل إلى تبسيط وعندما تكون الإنتاجية العالية مطلوبة. تجمع العملية بين كل من الإنزيمات - النسخ المتساقط و polymerase DNA - في رد فعل واحد. هذه الطريقة أسرع وتقلل من خطر التلوث بين الخطوات.
● المزايا:
○ تباين أقل تجريبية.
○ عدد أقل من خطوات الأنابيب ، مما يقلل من خطر التلوث.
○ مناسب للتطبيقات عالية الإنتاجية.
● العيوب:
○ لا يمكن تحسين شروط النسخ العكسي و PCR بشكل منفصل.
○ أقل حساسية من خطوتين RT-PCR ، حيث أن ظروف التفاعل هي حل وسط.
في RT-PCR من خطوتين ، يتم إجراء عمليات النسخ العكسي وتضخيم PCR في ردود فعل منفصلة. أولاً ، يتم تحويل الحمض النووي الريبي إلى [كدنا] ، ثم يتم استخدام [كدنا] في رد فعل PCR منفصل لتضخيم التسلسلات الهدف المطلوبة.
● المزايا:
○ مرونة أكبر في تحسين ظروف التفاعل لكل من النسخ العكسي وتضخيم PCR.
○ يمكن تخزين [كدنا] المنتجة للاستخدام في المستقبل في ردود الفعل PCR متعددة.
● العيوب:
○ المزيد من الوقت يستغرق وقتًا طويلاً وكثافة عمالة.
○ خطر أكبر للتلوث بسبب التعامل مع أنابيب وعينات متعددة.
تم تصميم آلات RT-PCR لاستيعاب المتطلبات المحددة لعملية RT-PCR. وتشمل هذه:
● cycler الحرارية: مكون أساسي من آلة RT-PCR ، فإن cycler الحرارية مسؤولة عن تنظيم درجة الحرارة أثناء عملية PCR. يضمن Cycler الحراري درجات الحرارة اللازمة للنسخ ، الصلب ، والتمديد ، وكذلك للنسخ العكسي.
● نظام الكشف البصري: تم تجهيز أنظمة PCR في الوقت الفعلي بنظام الكشف البصري يقيس التألق أثناء عملية التضخيم. يتضمن هذا النظام مصدرًا للضوء (عادةً مصابيح LED) وكاشف (غالبًا ما يكون أنبوبًا ضوئيًا أو كاميرا CCD) لالتقاط الضوء المنبعث.
● برنامج لتحليل البيانات: يتضمن جهاز RT-PCR برنامجًا متطورًا يحلل بيانات التألق التي تم جمعها خلال كل دورة PCR. يحسب هذا البرنامج قيم CT ويولد منحنيات التضخيم ، والتي يتم استخدامها بعد ذلك للتحليل الكمي.
يتم استخدام RT-PCR على نطاق واسع في العديد من الحقول ، بما في ذلك:
1. تحليل التعبير الجيني: RT-PCR لا يقدر بثمن لدراسة التعبير الجيني عن طريق قياس مستويات مرنا في مختلف الأنسجة أو الخلايا. يمكّن ذلك الباحثين من فهم كيفية تنظيم الجينات استجابةً للمنبهات ، مثل الأمراض أو الأدوية أو العوامل البيئية.
2. اكتشاف الممرض: يستخدم RT-PCR عادةً للكشف عن فيروسات الحمض النووي الريبي ، مثل فيروس نقص المناعة البشرية ، الأنفلونزا ، و SARS-COV-2. من خلال قياس الحمض النووي الريبي الفيروسي في العينات السريرية ، يمكن أن يساعد RT-PCR في مراقبة مستويات العدوى وتوجيه قرارات العلاج.
3. البحث الوراثي والتشخيص: يلعب RT-PCR دورًا مهمًا في البحوث الوراثية ، بما في ذلك دراسة طفرات الجينات والاضطرابات الوراثية. كما أنه يستخدم في الاختبار التشخيصي لحالات مثل السرطان والأمراض الوراثية والالتهابات الميكروبية.
يعتمد مبدأ جهاز RT-PCR على مزيج من النسخ العكسي وتضخيم PCR ، مما يتيح اكتشاف جزيئات الحمض النووي الريبي وتقديرها. توفر المراقبة في الوقت الفعلي للتضخيم من خلال الكشف عن مضان بيانات كمية حساسة للغاية ، والتي لا تقدر بثمن في دراسات التعبير الجيني ، والكشف عن مسببات الأمراض ، والبحوث الوراثية. بدقة وتنوعها ، تظل RT-PCR أداة لا غنى عنها في كل من الأبحاث والتشخيص السريري.
إذا كنت تبحث عن أنظمة RT-PCR المتقدمة لدعم تطبيقات البحث أو التشخيص ، فإن الحلول الحديثة لدينا مصممة لتقديم نتائج دقيقة وموثوقة وفعالة. اتصل بنا اليوم لمناقشة كيف يمكن لآلات RT-PCR مساعدتك في تحقيق أهدافك البحثية بدقة عالية وحساسية. دعنا نساعدك في اختيار أفضل حلول RT-PCR لاحتياجات المختبر الخاصة بك.
