مقدمة إلى PCR الرقمية
PCR الرقمية (DPCR) هي تقنية PCR الثالثة التي تم تطويرها بعد PCR التقليدية و PCR الكمية في الوقت الفعلي (QPCR). يتمثل مبدأها الأساسي في تقسيم خليط التفاعل الذي يحتوي على جزيئات الحمض النووي المستهدف في عشرات الآلاف من وحدات التفاعل الدقيقة المستقلة (مثل الدرجات الصغيرة أو الميكروويلز) ، مع تضخيم PCR الفردي داخل كل وحدة.
بعد اكتمال التضخيم ، يتم إجراء اكتشاف نقطة النهاية (عادةً لإشارة مضان) على كل وحدة. يحدد وجود أو عدم وجود إشارة ما إذا كانت تلك الوحدة تحتوي على جزيء الحمض النووي المستهدف. من خلال حساب عدد الوحدات الإيجابية وتطبيق إحصائيات توزيع Poisson ، يمكن حساب رقم النسخة المطلقة للحمض النووي المستهدف في العينة الأصلية مباشرة.
تكمن الميزة الأساسية لـ PCR الرقمية في قدرتها على القياس الكمي المطلق دون الاعتماد على منحنى قياسي ، مما يؤدي إلى نتائج أكثر دقة وموثوقية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يحتوي على تسامح أعلى للمثبطات ويوضح حساسية ممتازة في اكتشاف أهداف وفرة منخفضة للغاية ، مثل الطفرات النادرة ، ومرض مسببات الأمراض ، والحمض النووي للورم (CTDNA).
مكّنت هذه الميزات DPCR من إظهار قيمة تطبيق هائلة وإمكانات في أبحاث علوم الحياة والتشخيص السريري ، بما في ذلك مجالات مثل خزعة السائل الورم ، وتشخيص ما قبل الولادة غير الغازي ، والكشف الدقيق للمرض المسببة للأمراض ، وتحليل التعبير الجيني ، وتقدير المكونات المعدلة وراثيا ، وتقييم المعارف المرجعية.
أنواع PCR الرقمية
يمكن تصنيف PCR الرقمي على نطاق واسع إلى ثلاثة أنواع رئيسية بناءً على طريقة التقسيم المستخدمة لفصل العينة إلى العديد من وحدات التفاعل الفردية:
PCR الرقمية القائمة على القطيرت
تقوم هذه الطريقة بتقسيم خليط PCR إلى عشرات الآلاف من قطرات الماء في الزيوت الصغيرة ، كل منها بمثابة microreactor مستقل PCR. يتم إنشاء القطرات باستخدام ميكروفلويديك ثم تعرض لتضخيم PCR. بعد التضخيم ، يتم تحليل القطرات بشكل فردي من أجل التألق لتحديد الأقسام الإيجابية أو السلبية. يوفر هذا النهج عددًا كبيرًا جدًا من الأقسام ويستخدم على نطاق واسع لحسوته ودقته.
PCR الرقمية القائمة على الرقاقة
الطرق الهجينة
تعزل كل استراتيجية تقسيم جزيئات الحمض النووي في مقصورات تفاعل منفصلة ، مما يتيح استخدام إحصائيات Poisson لقياس جزيئات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المستهدف بدقة عن طريق حساب الأقسام الإيجابية والسلبية. يؤثر اختيار طريقة التقسيم على عدد الأقسام وحجم التقسيم وتعقيد سير العمل ومتطلبات الأدوات.
إحصائيات Poisson في PCR الرقمية
كيفية حساب النسخ/قطرة ونسخ/ميكرولتر في PCR الرقمية؟
يتم حساب إجمالي عدد نسخ الجزيء المستهدف في جميع القطرات الصالحة للعينة عن طريق ضرب نسخ الجزيء المستهدف لكل قطرة مع عدد القطرات الصالحة. استنادًا إلى العدد المعروف لنسخ الجزيء المستهدف لكل قطرة (λ) وحجم القطرات ، يمكن أيضًا حساب النسخ لكل ميكرولتر.
ما هو سير عمل سلسلة PCR DropDX الرقمية؟
يبدأ سير العمل الرقمي PCR (DPCR) باستخراج الحمض النووي من العينة لعزل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. بعد الاستخراج ، يتم خلط الأحماض النووية النقية مع Mastermix PCR ، بما في ذلك الاشعال ، وتحقيقات الفلورسنت ، والنيوكليوتيدات ، والإنزيمات ، و Supermix متخصصة مصممة لتشكيل قطرة.
ما هو سير عمل سلسلة PCR RS32 الرقمية؟
مزايا وقيود PCR الرقمية
المزايا:
| ميزة | وصف |
| القياس الكمي المطلق | يعتبر مباشرة الجزيئات المستهدفة دون الحاجة إلى منحنى أو مرجع قياسي ، مما يحسن الموثوقية. |
| الدقة العالية والتكاثر | يوفر نتائج أكثر دقة وتتكاثر ، وخاصة بالنسبة للأهداف منخفضة الوفرة والتغيرات الطية الصغيرة. |
| حساسية فائقة | يكتشف تركيزات منخفضة للغاية من الأهداف ، مثل الطفرات النادرة ، ومرض مسببات التتبع ، و CTDNA. |
| ارتفاع التسامح مع مثبطات | التقسيم يقلل من تأثير مثبطات PCR ، مما يتيح القياس الكمي القوي حتى في العينات الصعبة. |
| لا الاعتماد على كفاءة التضخيم | تتأثر النتائج بالتغيرات في كفاءة PCR ، مما يؤدي إلى تقدير كمي أكثر دقة. |
عيوب:
| عيب | وصف |
| أضيق النطاق الديناميكي | يقيد العدد المحدود من الأقسام نطاق التركيزات المستهدفة التي يمكن قياسها بدقة ، وغالبًا ما تتطلب تخفيف العينة للأهداف الوفيرة للغاية. |
| تكلفة أعلى | المعدات والمواد الاستهلاكية لـ DPCR هي عمومًا أغلى من تلك الخاصة بـ QPCR. |
| انخفاض الإنتاجية | عادةً ما تقوم DPCR بمعالجة عدد أقل من العينات لكل تشغيل. |
| مجموعة محدودة كاشف مجموعة متنوعة | لا تزال مجموعات الكاشف التجارية محدودة في التنوع ، وحتى عدد أقل من المجموعات حصلت على مؤهل للاستخدام في المستشفيات. |
| مجموعات الكاشف غير القابلة للتكليف | نظرًا لأن طرق التقسيم تختلف ، فإن مجموعات الكاشف من مختلف الشركات المصنعة PCR الرقمية ليست قابلة للتبديل. |
مقارنة بين PCR الرقمية و qPCR
| ميزة/الجانب | في الوقت الحقيقي PCR (QPCR) | PCR الرقمية (DPCR) |
| الكمية | النسبي أو المطلق (يتطلب منحنيات أو مراجع قياسية) | مطلق (لا توجد معايير أو مراجع مطلوبة) |
| تنسيق رد الفعل | الجزء الأكبر PCR ، أحجام التفاعل المرن | عينة التقسيم ، وحدات التخزين الثابتة |
| تأثير كفاءة PCR | تتأثر بالتغيرات في كفاءة PCR (البيانات التي تم جمعها خلال المرحلة الأسية) | لا تتأثر بتغيرات كفاءة التضخيم |
| التسامح مع مثبطات | عرضة للمثبطات | ارتفاع التسامح مثبط |
| طريقة الكشف | الكشف في الوقت الحقيقي | اكتشاف نقطة النهاية |
| النطاق الديناميكي | نطاق ديناميكي واسع | أضيق النطاق الديناميكي |
| حساسية | تباين أعلى ، أقل حساسية للأهداف النادرة | يكتشف التغييرات الصغيرة والأهداف النادرة ، والحساسية العالية |
| استنساخ | معتدلة ، يمكن أن تتأثر بعوامل مختلفة | استنساخ أعلى |
| القوة الإحصائية | أدنى | أعلى |
| نضج البروتوكول | بروتوكولات راسخة | انتقال سهل من QPCR ، ولكن لا تزال البروتوكولات تتطور |
| إنتاجية | عالي | أدنى |
مقارنة بين PCR الرقمية (DPCR) وتسلسل الجيل التالي (NGS)
NGS مثالية لاكتشاف واسع ، حيث يحدد مجموعة واسعة من المتغيرات الوراثية والعلامات الحيوية دون معرفة مسبقة بالطفرات. إنه أمر أساسي بالنسبة لـ DPCR الشامل يوفر التحقق من صحة الحساسية والقياس الدقيق لأهداف محددة ، مما يجعله مناسبًا لتتبع الطفرات المعروفة أو المتغيرات النادرة مع مرور الوقت ، وخاصة في مراقبة الاستجابة للعلاج.
| NGS | الرقمية PCR | الرقمية PCR |
| حد الكشف | 10 ٪ -5 ٪ ل WGS و WES | 0.1 ٪ -0.001 ٪ |
| تحليل البيانات | دعم المعلوماتية الحيوية واسعة النطاق ، مطالبة تفسير البيانات | واضحة |
| متطلبات المعرفة طفرة | المعرفة المسبقة بالطفرات غير المطلوبة | مطلوب |
| نطاق الكشف | المئات إلى exome كاملة أو جينوم كامل | محدود |
| الكمية | شبه كمي | القياس الكمي المطلق |
| تم اكتشاف أنواع التعديلات | نسخ تغييرات الأرقام ، إعادة ترتيب الهيكلية ، SNV أو مثيلة التغيرات على الجينوم/الألواح بأكملها | ممكن على الجينات/المناطق المفردة |
| وقت التحول (TAT) | طويل | قصير |
| يكلف | عالي | قليل |
غالبًا ما يتم دمج هذه التقنيات في سير العمل: NGS للاكتشاف والتوصيف ، تليها DPCR للمراقبة الكمية الحساسة للأهداف المختارة. هذا التآزر ذو قيمة خاصة في الطب الدقيق ، وعلم الأورام ، ومراقبة الأمراض المعدية ، والاختبارات الجينية.
تطبيقات PCR الرقمية
الاستشهادات
Mu H ، Zou J ، Zhang H. (2024). الكشف الكمي لطفرات T315I من BCR :: ABL1 باستخدام تفاعل سلسلة بوليميريز الرقمية. خلية transfus الهيماتول. 17: S2531-1379 (24) 00030-0. doi: 10.1016/j.htct.2023.12.007. .1
Zhao Z ، Wang Y ، Kang Y ، et al. (2024). دراسة بأثر رجعي لاكتشاف مسببات الأمراض التي تقارن ثقافة الدم و PCR الرقمية المستقلة عن الثقافة. هيليون. 10 (6): E27523. doi: 10.1016/j.heliyon.2024.e27523. .2
ماو إس ، لين ي ، تشين X ، وآخرون. (2024). قطرة الرقمية PCR: طريقة فعالة للمراقبة والتقييم النذير للحد الأدنى من الأمراض المتبقية في JMML. BR J الهيماتول. 204 (6): 2332-2341. doi: 10.1111/bjh.19465. .3
تشن J ، Liu X ، Zhang Z ، وآخرون. (2024). علامات التشخيص المبكرة لسرطان الخلايا الحرشفية المريء: نسخ تحديد عدد الجينات تغيير العدد والكشف عن CFDNA. الاستثمار المختبر. 104 (10): 102127. doi: 10.1016/j.labinv.2024.102127. .4
هو ، دونغ إل ، يان دبليو وآخرون. (2024). نظام PCR متعدد الإرسال للكشف عن أربعة أحداث فول الصويا المعدلة وراثيا. مربع البحث. doi: 10.21203/rs.3.rs-4766822/v1. .5
Dong L ، Li W ، Xu Q ، et al. (2023). اختبار سريع متعدد الإرسال لطفيليات الملاريا البشرية بواسطة PCR الرقمية. كلين تشيم Acta. 539: 70-78. doi: 10.1016/j.cca.2022.12.001. .6
Kopylova KV ، Kasparov EW ، Marchenko IV ، et al. (2023). PCR الرقمية كأداة تشخيصية حساسة للغاية: مراجعة. مول بيو (موسك). 57 (5): 771-781. doi: 10.31857/s0026898423050051. [مقال باللغة الروسية] .7
لو آر ، وانغ ج ، لي م ، وآخرون. (2022). الكشف الكمي بأثر رجعي لـ SARS-COV-2 بواسطة PCR الرقمية التي تُظهر دقة عالية لعينات الحمل الفيروسية المنخفضة. J INFECT DEV CTRIES. 16 (1) ، 10-15. doi: 10.3855/jidc.15315. 8
مجموعة ذات صلة
| رقم القط | اسم |
| 3.02.03.0001 | BCR ABL P210/P190 Digital PCR اختبار كمية أنبوب واحد |
| 3.02.03.0005 | PIK3CA 11 طفرات الفحص الرقمي PCR |
| 3.02.03.0006 | Human JAK2 Gene V617F KITTINE MUSECTION KIT (طريقة PCR الرقمية) |
| 3.02.03.0008 | Malaria 18S RRNA KITTECTION (PCR Digital) |
| 3.02.03.0009 | Fastplex ™ BCR-ABL (P210) ٪ هو مجموعة PCR الرقمية |
| 3.02.01.4066 | Mastermix الرقمية PCR للتحقيقات |
| 3.02.01.4071 | البشرية جين الجين G1269A فحص الطفرة |
| 3.02.01.4072 | البشرية جين جين V600E الفحص لاكتشاف الطفرة |
| 3.02.01.4073 | البشرية EGFR الجين G465R فحص الطفرة |
| 3.02.01.4074 | البشري EGFR الجين G719S فحص الطفرة |
| 3.02.01.4075 | البشرية EGFR الجين G719A فحص الطفرة |
| 3.02.01.4076 | الجين البشري EGFR الجين E746_A750DELELREA (COSM6223) |
| 3.02.01.4077 | الجين البشري EGFR الجين E746_A750DELELREA (COSM6225) مقايسة الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4078 | جين EGFR البشري L747_A750Delinsp (COSM2238) اختبار الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4079 | الجين البشري EGFR L747_A750Delinsp (COSM2239) اختبار الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4080 | الجين البشري EGFR L747_P753> اختبار الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4081 | البشري EGFR الجين S768i فحص الطفرة |
| 3.02.01.4082 | Human EGFR GENE V769_D770INSASV الفحص الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4083 | جين EGFR البشري D770_N771insg فحص الطفرة |
| 3.02.01.4084 | البشري EGFR جين T790M فحص الطفرة |
| 3.02.01.4085 | جين EGFR البشري C797S (COSM6493937) اختبار الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4086 | جين EGFR البشري C797S (COSM5945664) اختبار الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4087 | البشري EGFR الجين L858R فحص الطفرة |
| 3.02.01.4088 | البشري EGFR الجين L861Q فحص الطفرة |
| 3.02.01.4089 | البشرية ESR1 الجين Y537S فحص الطفرة |
| 3.02.01.4090 | البشرية ESR1 الجين D538G فحص الطفرة |
| 3.02.01.4091 | البشرية كراس جين G12D فحص الطفرة |
| 3.02.01.4092 | البشرية جين جين G12V فحص الطفرة |
| رقم القط | اسم |
| 3.02.01.4093 | البشرية جين جين G12C فحص الطفرة |
| 3.02.01.4094 | البشرية كراس جين G12A فحص الطفرة |
| 3.02.01.4095 | البشرية جين جين G12S فحص الطفرة |
| 3.02.01.4096 | البشرية كراس جين G13D فحص الطفرة |
| 3.02.01.4097 | البشري NRAS الجين G12V فحص الطفرة |
| 3.02.01.4098 | البشرية NRAS الجين Q61R فحص الطفرة |
| 3.02.01.4099 | البشرية PIK3CA Gene E542K اختبار الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4100 | البشرية PIK3CA Gene E545K اختبار الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4101 | البشرية PIK3CA GENE H1047R فحص الطفرة |
| 3.02.01.4102 | البشري TP53 الجين R175H اختبار الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4103 | Human TP53 الجين R248L اختبار الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4104 | Human TP53 الجين R273C اختبار الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4105 | Human TP53 الجين R273H اختبار الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4106 | الإنسان HER2 جينات نسخة الاختلاف الاختلاف اختبار الاختلاف |
| 3.02.01.4108 | الأنفلونزا البشرية فيروس H1N1 -2009 فحص الاكتشاف |
| 3.02.01.4109 | أنفلونزا الإنسان A Virus H3N2 فحص الكشف |
| 3.02.01.4113 | فحص الكشف فيروس إبستين بار (BAMHI-W) |
| 3.02.01.4114 | فيروس الكشف البشري إبشتاين بار (EBNA1) |
| 3.02.01.4115 | اختبار الكشف عن CMV البشري |
| 3.02.01.4117 | البشرية BCR-ABL T315I فحص الطفرة |
| 3.02.01.4120 | الإنسان IDH1 الجين R132C فحص الطفرة |
| 3.02.01.4121 | الإنسان IDH1 الجين R132G فحص الطفرة |
| 3.02.01.4122 | الإنسان IDH1 الجين R132H اختبار الكشف عن الطفرة |
| 3.02.01.4123 | البشرية myd88 الجين L265p فحص الطفرة |
| 3.02.01.4130 | Human BCR-ABL (P210) مجموعة الكشف عن الجينات الانصهار (PCR الرقمية) |
| 3.02.01.4138 | اختبار الكشف البشري BCR-ABL P190 |
| 3.02.01.4265 | مجموعة الكشف عن SARS-COV-2 (RT-DPCR) |
| 3.02.01.4277 | تعفن الدم الممرض الكشف عن الكشف الدقيق (PCR الرقمية) |
